KINETIKA REKASI ENZIM

PERCOBAAB III

KINETIKA REAKSI ENZIM

A.    TUJUAN:

Diharapkan dapat memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim.

B. TEORI DASAR:

            Enzim merupakan protein yang mengkatalisis reaksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolisme perantara dari sel. Enzim bekerja dengan urutan yang teratur, enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrient, reaksi yang menyimpang dan mengubah energi kimiawi dan yang membuat makromolekul sel dari precursor sederhana. Enzim bekerja dengan menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia tanpa mengubah keseluruhan perubahan energi bebas reaksi atau letak kesetimbangan akhir. Enzim sebagai katalisator menurunkan energy aktivasi reaksi-reaksi kimia dan meningkatkan fraksi molekul di dalam suatu populasi molekul tertentu untuk lebih cepat bereaksi per satuan waktu dibandingkan dengan keadaan tanpa katalisator. Enzim juga bergabung dengan substratnya selama siklus katalitiknya. Analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim dapat dilakukan dengan dua asas pendekatan yaitu asas keseimbangan menurut Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (steady state theory) menurut Briggs-Haldone.

           

            Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim adalah konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu, pengaruh pH, dan pengaruh inhibitor. Pengukuran jumlah enzim berdasarkan kecepatan reaksi yang dikatalisisnya

Cara : dibandingkan dengan enzim murni yang diketahui kadarnya. Satuan : µg. Berdasarkan ml jumlah substrat yang bereaksi atau produk yang terbentuk per satuan waktu. Satuan : unit. 1 i.u : Jumlah enzim yang mengkatalisis pembentukan 1 µ mol produk per menit pada kondisi 25°C pada keadaan pengukuran optimal. Jumlah substrat yg diubah atau produk yang dihasilkan per satuan waktu. Aktifitas spesifik adalah jumlah unit enzim per miligram protein, yang merupakan suatu ukuran kemurnian enzim. Bilangan putaran suatu enzim adalah jumlah molekul sustrat yang terubah per satuan waktu oleh suatu molekul enzim (atau oleh satu sisi katalitik), jika konsentrasi enzim sendiri merupakan faktor pembatas kecepatan reaksi.

Beberapa enzim tidak memerlukan komponen tambahan untuk mencapai aktivitas penuhnya. Namun beberapa memerlukan pula molekul non-protein yang disebut kofaktor untuk berikatan dengan enzim dan menjadi aktif. Kofaktor dapat berupa zat anorganik (contohnya ion logam) ataupun zat organik (contohnya flavin dan heme). Kofaktor dapat berupa gugus prostetik yang mengikat dengan kuat, ataupun koenzim, yang akan melepaskan diri dari tapak aktif enzim semasa reaksi. Enzim yang memerlukan kofaktor namun tidak terdapat kofaktor yang terikat dengannya disebut sebagai apoenzim ataupun apoprotein. Apoenzim beserta dengan kofaktornya disebut holoenzim (bentuk aktif). Kebanyakan kofaktor tidak terikat secara kovalen dengan enzim, tetapi terikat dengan kuat. Namun, gugus prostetik organik dapat pula terikat secara kovalen (contohnya tiamina pirofosfat pada enzim piruvat dehidrogenase). Istilah holoenzim juga dapat digunakan untuk merujuk pada enzim yang mengandung subunit protein berganda, seperti DNA polimerase. Pada kasus ini, holoenzim adalah kompleks lengkap yang mengandung seluruh subunit yang diperlukan agar menjadi aktif.

            Enzim mempunyai kekhasan yaitu hanya bekerja pada satu reaksi saja. Untuk dapat bekerja terhadap suatu zat atau substrat harus ada hubungan atau kontak antara enzim dengan substrat. Suatu enzim mempunyai ukuran yang lebih besar daripada substrat. Oleh karena itu, tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan dengan substrat dengan enzim hanya terjadi pada bagian atau tempat tertentu saja. Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat dinamai bagian aktif. Hubungan hanya mungkin terjadi apabila bagian aktif mempunyai ruang yang tepat dapat menampung substrat. Apabila substrat mempunyai bentuk atau konformasi lain, maka tidak dapat ditampung pada bagian aktif suatu enzim. Dalam hal ini enzim itu tidak dapat berfungsi terhadap substrat.

C.  ALAT DAN BAHAN

ALAT             :                                                           BAHAN         :

- Gelas-gelas piala 50 ml dan 10 ml                         - Larutan TCA 20%

- Tabung reaksi                                                         - Larutan kasein 2% (b/v)

- Pengaduk gelas                                                      - Larutan dapar fosfat 0,1M pH 8

- Pipet ukur 1 ml, 5 ml dan 10 ml                            - Larutan NaOH 0,5 N

- Pipet tetes                                                              - Aquadest

- Water bath 35˚C                                                    - Reagen Folin-Ciocalteu

- Kertas saring                                                          - Larutan tripsin (10 mg tripsin

- Kuvet                                                                        dalam 25 ml dapar fosfat 0,1 M

- Spektrofotometer/calorimeter                                   pH 8,0).

- Corong kaca.

D. PROSEDUR

PROSEDUR / CARA KERJA

HASIL PENGAMATAN

Tabung t = 0 menit 5 tabung reaksi berpengaduk     Ditambahkan Buffer pH 8. Pada tabung 1 berisi 5,9 ml,  tabung 2 berisi 5,5 ml, tabung 3 berisi 5 ml, tabung 4 berisi 3 ml, dan tabung berisi 1 ml   Ditambahkan tripsin pada semua tabung masing-masing 1 ml Pada masing-masing tabung ditambahkan 3 ml larutan TCA 20% dan diaduk perlahan Diinkubasi selama 30 menit dalam water bath 35˚C Ditambahkan larutan kasein. Pada tabung 1 berisi 0,1 ml, tabung 2 berisi 0,5 ml, tabung 3 berisi 1 ml, tabung 4 berisi 3 ml, dan tabung 5 berisi 5 ml. Disentrifuga selama 10 menit, dan kemudian disaring dengan kertas saring Difiltrat lebih lanjut dengan metode Anson: Dicampurkan 2 ml TCA-filtrat diatas dengan 4 ml NaOH 0,5 M Ditambahkan 1 ml larutan Folin-Ciocalteu (1 volume reagen ditambah 1 volume aquades sehngga mengandung 1 N asam) Didiamkan selama 10 menit kemudian tetapkan serapannya pada 650 nm. Tabung t = 20 menit 5 tabung berpengaduk Ditambahkan larutan kasein. Pada tabung 1 berisi 0,1 ml, tabung 2 berisi 0,5 ml, tabung 3 berisi 1 ml, tabung 4 berisi 3 ml, dan tabung 5 brisi 5 ml. Diinkubasi didalam water bath 35˚ C selama 5 menit, sambil terus diaduk perlahan (jangan sampai berbusa) Ditambahkan berturut-turut larutan buffer fosfat. Pada tabung 1 berisi 5,9 ml, tabung 2 berisi 5,5 ml, tabung 3 berisi 5 ml, tabung 4 berisi 3 ml, dan tabung 5 berisi 1 ml. Ditambahkan juga larutan tripsin 1 ml masing-masing pada setiap tabung Diinkubasi selama 20 menit dalam inkubator 35˚C dihitung setelah penambahan tripsin Rekasi dihentikan dengan penambahan 3 ml TCA 20% kedalam masing-masing tabung dan diaduk dengan kuat   Didiamkan selama 20 menit dalam air es untuk menyempurnakan pengendapan Disentrifuga selama 10 menit, kemudian disaring untuk diambil supernatanya disaring dengan kertas saring Difiltrat lebih lanjut dengan metode Anson: Dicampurkan 2 ml TCA-filtrat diatas dengan 4 ml NaOH 0,5 M Ditambahkan 1 ml larutan Folin-Ciocalteu (1 volume reagen ditambah 1 volume aquades sehngga mengandung 1 N asam) Didiamkan selama 10 menit kemudian tetapkan serapannya pada 650 nm.

C. PENGOLAHAN DATA

      Perhitungan:

D. PEMBAHASAN:

Pada percobaan ini, data yang diperoleh tersebut yaitu dari tabung satu sampai tabung lima, larutan berwarna putih keruh yang terbentuk dilapisan atas semakin banyak dan bagian larutan yang bening semakin sedikit, akibat karena penambahan kasein dari tabung satu sampai tabung lima semakin banyak sedangkan  larutan Buffer fosfat dari tabung satu sampai tabung lima semakin sedikit. Dalam hal ini tripsin berperan sebagai enzim yang akan dianalisis kinetika reaksinya yang mempunyai pH 6-8 sedang kasein berperan sebagai substrat yang akan bereaksi dengan tripsin (enzim). Yang dimana suatu enzim mempunyai ukuran yang lebih besar daripada substrat. Oleh karena itu tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan dengan subsrtat. Hubungan antara substrat dengan enzim hanya terjadi pada bagian atau tempat tertentu saja. Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat dinamakan sebagai bagian aktif (active site). Hubungan hanya mungkin terjadi apabila bagian aktif mempunyai bentuk atau konformasi lain, maka tidak dapat ditampung pada bagian aktif suatu enzim. Dalam hal ini tidak dapat berfungsi terhadap substrat. Hubungan atau kontak antara enzim dengan substrat menyebabkan terjadinya kompleks yang aktif, yang bersifat sementara dan akan terurai lagi apabila reaksi yang diinginkan telah terjadi. Bila konsentrasi substrat diperbesar, makin banyak substrat yang dapat berhubungan dengan enzim pada bagian aktif tersebut. Dengan demikian, konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar dan hal ini menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Namun dalam keadaan ini, bertambah besarnya konsentrasi susbstrat tidak menyebabkan bertambah besarnya konsentrasi kompleks enzim substrat, sehingga jumlah hasil reaksinya pun tidak bertambah besar. Dan Larutan buffer posfat berfungsi sebagai larutan penyangga yang mempertahankan pH larutan tetap berada pada pH 8, yaitu pH yang optimum untuk aktivitas enzim dalam bereaksi dengan substrat. Karena struktur ion enzim tergantung pada pH lingkungan. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektifitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. Sedangkan larutan TCA 20% ditambahkan berfungsi untuk menghentikan jalannya reaksi hidrolisis antara tripsin dan kasein dengan cara mendenaturasi tripsin sehingga mampu menghentikan reaksi enzimatis karena sifatnya yang asam. Kemudian dinkubasi pada T = 0 menit selama 30 menit dalam water bath 35˚C. setelah penambahan larutan TCA 20% pada tabung dimaksudkan untuk memberikan waktu kepada TCA dalam memutuskan ikatan-ikatan protein pada enzim (mendenaturasi protein) sehingga enzimnya hancur. Sedang inkubasi pada T = 20 menit setelah penambahan tripsin dimaksudkan untuk memberikan waktu yang cukup untuk enzim dalam menghidrolisa substratnya.

Pada percobaan ini juga dilakukan suatu proses yang dinamakan sentrifugasi. Proses ini berfungsi untuk memisahkan partikel koloid (s) dari larutannya. Dengan kata lain, proses ini berfungsi untuk memisahkan endapan dari campurannya. Sedangkan penyimpanan tabung pada air es dimaksudkan untuk menyempurnakan pembentukan endapan. Pada suhu yang lebih dingin, kelarutan suatu zat akan mengecil sehingga kemungkinan pembentukan endapan menjadi semakin besar. Oleh karena itu, penyimpanan tabung pada air es ini mampu menyempurnakan pembentukan endapan. Sebab reaksi yang menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah reaksi kimia berlansung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlansung lebih cepat. Pada suhu >60˚C maka enzim akan rusak dan denaturasi pada suhu <0˚C enzim tidak aktif tetapi tidak rusak secara reversibel. Suhu lebih rendah atau lebih tinggi dari suhu optimum membuat aktifitas enzim berkurang. Disamping itu enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila terjadi denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya pun akan menurun. Kenaikan suhu sebelum terjadinya denaturasi dapat menaikan kecepatan reaksi. Koefisien suhu suatu reaksi diartikan sebagai kenaikan kecepatan raksi sebagai akibat kenaikan suhu 10˚C. Koefisien suhu ini diberi simbol Q10. Untuk reaksi yang menggunakan enzim Q10 berkisar antara 1,1 hingga 3,0 kali. Larutan tripsin merupakan protein menjadi peptida dan asam amino. Dan kasein merupakan protein khusus berasal dari susu.

Sampel yang diberikan perlakuan metoda anson seharusnya bereaksi membentuk senyawa berwarna biru bening dan mampu dibaca oleh spektrofotometer pada panjang gelombang 650 nm. Namun pada percobaan ini, sampel berubah warna menjadi kuning kehijauan. Oleh karena itu dilakukan rescanning dengan alat UV visible untuk mencari panjang gelombang maksimum dari warna kuning kehijauan tersebut. Dan didapatkan panjang gelombang maksimum pada 400 nm. Semakin banyak kasein yang ditambahkan, maka akan semakin banyak reaksi hidrolisan yang dilakukan enzimnya. Angka ini akan membuat warna kuning kehijauan larutan pada metoda anson menjadi semakin pekat dan enyebabkan nilai absorbansi sampel tersebut semakin besar berdasarkan pembacaan spektrofotometer. Namun pada percobaan yang dilakukan, nilai absorbansinya naik turun sehingga grafik yang terbentuk pun tidak baik. Hal ini kemungkinan terjadi karena terjadi kesalahan pada beberapa tahapan prosedur yang dilakukan.

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan  sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.

Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer,

Keterangan  :

Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorptivitas

b = Panjang sel/kuvet

c = konsentrasi (g/l)A = Absorban

Kecepatan reaksi kinetika enzim yang paling tinggi terjadi di awal masa inkubasi. Hal ini terjadi karena pada saat itu kondisi enzim masih sangat baik dalam menghidrolisis substratnya. Namun pada grafik percobaan ini, terjadi banyak distorsi dikarenakan dikerjakan oleh 2 kelompok berbeda yang keabsahan pengerjaannya tidak diketahui dengan pasti dan keterbatasan waktu yang ada.

Grafik hubungan V dan S seharusnya terus menaik ke atas hingga dicapai V maksimum, setelah mencapai V maksimum, titik-titik pertemuan antara sumbu x dan sumbu y seharusnya membentuk garis vertikal karena substrat habis dan kecepatan menjadi stabil pada angka itu. Namun pada grafik hasil percobaan, garisnya masih naik dan turun, hal ini terjadi karena beberapa kesalahan ketika percobaan berlangsung.

E. KESIMPULAN:

·         Enzim bekerja dengan menurunkan enegi aktivasi tanpa mengubah keseluruhan perubahan energi bebas reaksi.

·         Fungsi ditambahkan TCA untuk mengnonaktifasikan enzim

·         Larutan buffer posfat berfungsi sebagai larutan penyangga yang mempertahankan pH larutan tetap berada pada pH 8, yaitu pH yang optimum untuk aktivitas enzim dalam bereaksi dengan substrat.

·         Ketika semua enzim berada dalam keadaan ES (jenuh oleh substrat), laju reaksi mencapai nilai maksimum pada kecepatan absorban per detik.

·         Beberapa faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim diantaranya adalah derajat keasaman (pH), suhu inkubasi, dan ada tidaknya inhibitor.

·         V maksimum didapat sebesar 0,0118 dan Km didapat sebesar -0,0405

F. DAFTAR PUSTAKA:

·         Poedjiadi, anna dan Suprianti, Titin. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas

Indonesia: Jakarta

·         Wirahadikusummah, M., 1985. Biokimia: Protein, Enzim, dan Asam Nukleat.

ITB: Bandung

·         http://josuasilitonga.wordpress.com/2010/10/07/enzim/ (12-12-2010)

·         http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/spektrofotometri/

(12-12-2010)

·         http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzymeexplorer/

analytical-enzymes/trypsin/trypsin-inhibitors.html (12-12-2010)